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ES&T:美格基因发布世界首款蓝藻检测基因芯片


发布时间:

2024-03-18

美格基因发布世界首款蓝藻检测基因芯片,并于Environmental Science & Technology发表文章《CyanoStrainChip: 基于DNA微阵列技术的环境蓝藻菌株水平高通量检测芯片》

CyanoStrainChip: A Novel DNA Microarray Tool for High-Throughput Detection of Environmental Cyanobacteria at the Strain Level

CyanoStrainChip: 基于DNA微阵列技术的环境蓝藻菌株水平高通量检测芯片

文章标题:CyanoStrainChip: 基于DNA微阵列技术的环境蓝藻菌株水平高通量检测芯片

期刊:Environmental Science & Technology [IF=11.4]

原文链接:https://doi.org/10.1021/acs.est.3c11096

发表时间:2024-03-07

第一作者:Hao-Yue Shu (束浩月)

通讯作者:Tao Jin (金桃);Jian Yang (杨剑);Wen-Sheng Shu (束文圣)

合作作者:Liang Zhao (赵亮);Yanyan Jia (贾妍艳);Fei-Fei Liu (刘飞飞);Jiang Chen (陈江);Chih-Min Chang (张智闵)

主要单位:

(1)云顶电子游戏娱乐场

(2)壹健生物科技(苏州)有限公司

(3)华南师范大学生命科学学院 

(4)深圳职业技术大学食药学院

(5)中山大学生态学院

 

摘要

蓝藻(Cyanobacteria)在各种地球生境中广泛存在,它们是自然生态系统中不可或缺的一环。在特定情况下,蓝藻还可能引发有害水华造成经济损失,形成人类健康风险。因此检测自然环境中的蓝藻无论是对于科学研究还是蓝藻水华相关的污染监测与治理都具有重要意义。然而,目前环境中的蓝藻检测方法,很难兼顾高通量和高物种分辨率。比如16S rRNA测序只能鉴定环境蓝藻到属水平,这让使用了相关方法的研究完全忽略了蓝藻的种内变异(Intraspecific Variation)。因此我们开发DNA微阵列工具CyanoStrainChip,用以对环境中的蓝藻进行菌株水平的高通量鉴定。CyanoStrainChip上布置了43,666个全基因组分布、菌株特异的检测探针以针对 1,277株蓝藻,包括了几乎所有主要蓝藻种群。模拟群落实验证明CyanoStrainChip的高精准度和在复杂背景DNA下的抗干扰检测能力。探针荧光强度与添加DNA量之间的高相关性(Pearson's R > 0.97)证明其具有优秀的定量检出能力。通过比较同一批野外样本的CyanoStrainChip分析结果与宏基因组和16S rRNA测序结果,发现其与两种测序方法的检测结果可以相互验证与补充。此外,通过对巢湖表面水样品进行分析,发现在不同严重程度的蓝藻水华中微囊藻属(Microcystis)内不同菌株丰度变化的高异质性,突出了微囊藻属中的两个产毒菌株可能是巢湖蓝藻水华爆发的罪魁祸首。这些研究结果表明CyanoStrainChip性能优越,是一个极具价值的蓝藻生态研究和蓝藻水华生物监测工具。

 

背景介绍

蓝藻(Cyanobacteria)在各种地球生境中广泛存在,它们是自然生态系统中不可或缺的一环,是地球氧气大气的重要贡献者,还是大量次生代谢产物的生产者。在特定情况下,蓝藻还可能引发有害水华,释放毒素进入淡水和海洋环境,对生态系统结构和功能以及饮用和渔业水质构成破坏,造成经济损失,形成人类健康风险。因此,对各种生态系统中蓝藻多样性和丰度进行检测对于环境生态学研究和有害藻华的污染监测与治理至关重要。

然而,目前的环境蓝藻相关研究普遍忽视了蓝藻的种内变异(Intraspecific Variation),即几乎完全不考虑即使是来自同一蓝藻种属的不同菌株也可能存在较大特性差异。已有众多文献通过对同属(比如Raphidiopsis、PlanktothrixMicrocystis)的多个分离纯培养菌株的比较研究发现它们在生理生态、毒素产出和遗传等方面广泛存在丰富的种内多样性。

在高通量方法中,基于特定DNA片段(例如16S rRNA,藻清蛋白基因和藻毒素合成基因等)的扩增子测序是最为常用的环境蓝藻检测方法,但是因为目标片段只能限制在几百个bp长度,因此其物种分辨率十分受限,通常只能定位到属或者是属以上水平。而宏基因组测序虽然可以进行菌株识别,但是测序的费用成本不菲且分析难度大,计算资源要求高,定量效果不佳。

DNA微阵列(Microarray)是一块带有特殊涂层的玻璃载片,在数平方厘米的面积上安装数千或数万个核酸探针,其最初被开发用于模式动植物的比较转录组研究,而后开始被应用于环境、医学等多个领域内的微生物鉴定。与基于测序的微生物检测方法相比,微阵列有自己的独特优势,比如其可重复性好、定量效果优越和易于使用。鉴于高密度DNA微阵列技术的日渐成熟和全球蓝藻全基因组序列的快速积累,我们决定开发一款用于高通量和高分辨率环境蓝藻检测的DNA微阵列工具,命名为CyanoStrainChip。

 

结果

结果一:探针筛选与芯片设计

图1. CyanoStrainChip研发关键步骤

CyanoStrainChip研发主要步骤如图1所示。首先我们在全基因组范围内筛选所有菌株的特异识别探针,这些探针需同时满足探针特异性和自身理化特性(包括与非靶菌株基因组的连续相似性限制、杂交自由能、探针二级结构、GC含量和熔解温度)的合理性。此外为减少非特异杂交(cross-hybridization)对CyanoStrainChip灵敏度和特异性的影响,我们为每个菌株都设置了数十个非重复的特异探针。CyanoStrainChip一共包含了43,666个探针,靶向1,277株蓝藻,这些菌株属于9个目(order)的40个科类(family)(图2)。其中大约80%的探针完全位于基因区内,6%的探针跨越了基因和基因间区,14%的探针完全位于基因间区。位于基因区内的探针被发现高度富集在细胞壁/膜/包膜生物合成、次生代谢产物生物合成以及胞内运输相关的基因。此外,我们发现约有1%的探针位于八种常见蓝藻毒素生物合成基因簇的基因区内,表明CyanoStrainChip具有区分不同产毒基因型蓝藻的潜力。CyanoStrainChip的另一个关键特征是包括均匀分布在阵列上的内控探针用以杂交一段人工合成序列。传统的微阵列数据归一化方法是基于样品之间目标DNA总量相等的假设,这显然对于环境样本是不符合实际情况。为了改进这个问题,我们在进行样本DNA荧光标记之前就将固定量人工合成核酸序列作为内控(spike-in control)添加到每个样品中。对模拟群落样本和野外样本的分析表明,利用内控探针信号对芯片数据进行标准化相比较于传统的信号总值归一化方法可以提供更符合实际的数据,有效减少包括荧光标记、杂交等实验过程中产生的非生物学误差。

图2. CyanoStrainChip目标检测蓝藻的分布

结果二:芯片性能验证

基于23个纯培养蓝藻的模拟群落分析显示,虽然非特异杂交(cross-hybridization)在结果中依然非常普遍,但是这些非特异杂交产生的探针在单个菌株中的比例都较低。添加菌株(即真阳性)跟非添加菌株(即假阳性)中特异探针具有显著荧光信号的比例(Probe Detection Rate, PDR)的密度曲线可以观察到有明显分歧(图3C),这给我们提供了一个思路,那就是利用PDR在CyanoStrainChip检出结果中识别出假阳性的菌株并删除(我们假设某一菌株中绝大部分探针都是由非特异杂交引起的概率非常低)。以PDR作为检出条件计算的ROC和PR曲线支持了我们这一想法(图3D和E)。

利用纯菌DNA的连续浓度梯度杂交实验对CyanoStrainChip的检出最低限度和定量效果进行了评估(图4)。结果表明,当添加的DNA为1 ng,添加菌株的绝大部分的探针都出现了显著荧光信号,意味着满足了我们设定的PDR > 0.75的真阳性检出标准。虽然CyanoStrainChip的检出灵敏度相对于16S rRNA测序或者其他包含有PCR过程的方法更低,但是也避免了PCR过程中可能会导致的一些假阴性结果。而添加DNA量与菌株探针荧光信号的相关性分析表明,在一定范围内(1~100 ng)CyanoStrainChip具有很好的定量效果。当然我们需要注意的是,因为芯片杂交的分子原理,CyanoStrainChip依然属于半定量工具而非绝对定量工具。

图3. CyanoStrainChip分析模拟群落实验

图4. CyanoStrainChip敏感度与定量效果评估

结果三:CyanoStrainChip分析巢湖蓝藻水华水样

利用CyanoStrainChip对巢湖不同程度藻华水样中的蓝藻进行了分析(三种水样分别被标记为“Low”、“Medium”和“High”,对应叶绿素浓度分别为17.7,74.1和144.2 μg/L)。结果发现,随着藻华爆发程度的增加,蓝藻群落中检出的蓝藻菌株数目没有显著变化,但是群落的alpha多样性急剧下降(图5A)。这意味着是群落中的极少部分物种的急剧爆发引起了藻华,导致了群落结构的失衡。我们观察到的结果与目前已有文献报道相符合。进一步对主要检出蓝藻类群中的全部菌株在不同程度藻华水体中的丰度变化进行分析,发现引起巢湖藻华爆发的主要类群是Microcystis。特别值得注意的是,即使是Microcystis属内不同的菌株,丰度变化趋势也具有很高的异质性(图5B)。其中两株产毒菌株Microcystis aeruginosa KW 和Microcystis aeruginosa NIES-843被发现具有最强的爆发趋势。这一发现验证了之前一项关于太湖蓝藻爆发的研究,他们发现虽然太湖中鉴定出了20种不同基因型的Microcystis,但藻华爆发却只由其中的少数几种基因型主导。相比较下,CyanoStrainChip带来的全新发现是精确鉴定了具体的主导菌株,这对未来指导巢湖蓝藻水华控制很有意义。

图5. CyanoStrainChip分析巢湖蓝藻水华水样

结果四:CyanoStrainChip与二代测序方法的比较分析

对来自巢湖的野外样本我们分别用CyanoStrainChip和16S rRNA测序进行蓝藻群落分析并比较两者结果。在多样性方面,两者均发现了随着藻华爆发alpha多样性持续下降的规律。而在物种组成方面,虽然两者依然有很多各自鉴定到的类群,但是这些各自单独鉴定出的类群在整体蓝藻群落中的丰度都比较低,意味着对于主要的类群两种方法都可以成功检出。主要类群在两种方法中的检出丰度表现出了较好的相关性,证明了CyanoStrainChip的野外样本分析结果是可靠的。此外我们还对一个来自大沙河的藻华水样分别利用CyanoStrainChip和宏基因组测序的方法进行分析。我们发现两种方法鉴定出的菌株在完整度和丰度两个层面都具有较高的相关性。当然,不能忽略的是这两种方法同样还有一些各自单独检出的蓝藻。这些结果表明了CyanoStrainChip的可靠性,同时也意味着多种方法的联合使用可能会带来更为全面的环境蓝藻群落画像。

 

总结

结合模拟群落和野外样本实验,我们证实了CyanoStrainChip性能优越,是一个极具价值的蓝藻生态研究和蓝藻水华生物监测工具。然而不能忽略的是CyanoStrainChip所针对的是预先设定的好的一千多个目标菌株。我们坚持在这款芯片中并不囊括针对未知菌株的检出探针,是为了最小化非特异杂交可能带来的假阳性错误。一方面,CyanoStrainChip与可以鉴定出未知物种的二代测序方法形成优势互补,在实际应用中我们应鼓励对它们的联合使用。另一方面,蓝藻的全基因组数据还在持续增加,应保持芯片设计的持续更新升级,以覆盖更多的蓝藻类群。最后,我们相信这款芯片的价值还在于提供了一个非常全面的模板,展示了如何利用全基因组的数据和DNA芯片技术来定制针对特定微生物类群的高分辨率检测工具。

 

美格基因芯片定制服务

产品介绍

基因芯片(Gene Chip)又称DNA微阵列(DNA Microarray),是将大量已知序列探针集成在同一个基片上, 经过荧光标记的待测目标DNA与芯片特定位点上的探针杂交, 再通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、准确、高效的检测。基因芯片以其快速和高通量的独特优势,成为微生物检测的新兴技术。美格基因的多款独家微生物基因芯片产品在科研服务、生态环境、农业等领域得到了广泛的应用,助力客户取得研究成果。基于丰富的项目经验及技术积累,美格基因隆重推出基于杂交芯片技术原理,用于研发特定物种或功能基因检测体系的个性化基因芯片定制服务—美格基因芯片定制服务,致力于推动基因芯片技术在科学研究和环境监测等领域的应用。

图6. 定制服务流程图

代表产品—CyanoStrainChip

针对蓝藻准确快速检测需求开发的一款高度专业化、集成化的基因芯片。该产品基于1,277株蓝藻完整基因组序列设计探针,每张芯片包含8*60K的检测探针阵列,可对8~16个样本进行蓝藻的株水平识别和半定量检测,可应用于各种水体和土壤结皮中的蓝藻检测。

图7. 蓝藻芯片(CyanoStrainChip)

定制基因芯片优势

芯片定制接入条件

(1)物种识别数量推荐为50~2,000个,具体数量需结合客户需求和目标基因组序列可识别特异探针数量进行灵活调整。

(2)用于芯片实验验证的纯培养单菌数推荐为目标物种数量的10%左右,多多益善。

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